Określenie zmian związanych z hipokampem i różnic płciowych w myszach AMOTL1 KO – AMOTL 1PD

Projekt realizowany w przez:

Sieć Badawcza Łukasiewicz – PORT Polski Ośrodek Rozwoju Technologii

Celem projektu jest określenie funkcji, jaką białko 1 podobne do angiomotyny (angiomotin-like 1 – AMOTL1) pełni w strukturze mózgu, jaką jest hipokamp. Struktura ta jest odpowiedzialna za konsolidowanie pamięci krótkotrwałej do długotrwałej, a tym samym za proces uczenia się i pamięci, a oprócz tego także za emocje, regulowanie aktywności ruchowej oraz odpowiedzi na stres. W myszach transgenicznych pozbawionych ekspresji genu dla białka AMOTL1 zaobserwowaliśmy szereg fenotypów typowych dla niektórych chorób neuropsychiatrycznych związanych właśnie z hipokampem.

W niniejszym projekcie zweryfikujemy hipotezę mówiącą o tym, że do prawidłowego funkcjonowania struktury hipokampa białko AMOTL1 jest niezbędne. W tym celu stworzymy myszy modyfikowane genetycznie, w których białko AMOTL1 nie będzie produkowane w hipokampie.

Motyny to rodzina białek grupująca w sobie trzech przedstawicieli: angiomotynę (AMOT), białko 1 podobne do angiomotyny (AMOTL1) oraz białko 2 podobne do angiomotyny (AMOTL2). Białka te biorą udział w regulacji funkcjonowania złącz szczelinowych, adhezji i migracji komórek. Niektóre badania wskazują także na udział angiomotyn w procesie nowotworzenia. Niewiele natomiast wiadomo na temat roli, jaką agniomotyny pełnią w ośrodkowym układzie nerwowym i w komórkach nerwowych.

Do tej pory opublikowano cztery artykuły, które wskazują na funkcję angiomotyn w mózgu. Wigerius et al. (doi: 10.1083/jcb.201705184) pokazali, że białko AMOT jest niezbędne do kontroli dojrzewania kolców dendrytycznych neuronów hipokamplanych in vitro. Cao et al. (https://doi.org/10.1038/s41419-023-06020-7) pokazali natomiast, że stabilność motyn (związana z poziomem ich ubikwitylacji) jest regulowana przez białka z rodziny WWC, a delecja genów dla białek WWC  prowadzi do zaburzenia procesu spinogenezy (powstawania kolców dendrytycznych) i do upośledzenia mechanizmów pamięci w mechanizmie zależnym od AMOT. Z kolei Zaltsman et al. zaprezentowali, że AMOT jest kluczowym białkiem w procesie różnicowania się neuronów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro (doi: 10.1016/j.stemcr.2019.03.009).

Ostatnia praca, autorstwa Rojek et al., pokazała natomiast, że delecja genu dla AMOT specyficzna dla dojrzałych komórek nerwowych prowadzi do zaburzeń związanych z móżdżkiem (na poziomie tkankowym, jak i behawioralnym – zaburzenia chodu i koordynacji ruchów u myszy) (doi: 10.1371/journal.pbio.3000253). Nasze badania wstępne pokazują, że pozostałe dwa białka należące do rodziny angiomotyn – AMOTL1 i AMOTL2, także ulegają ekspresji w komórkach nerwowych hipokampa, natomiast uniemożliwienie ich ekspresji specyficznie w neuronach prowadzi (podobnie jak w przypadku AMOT) do zaburzeń rozwoju kolców dendrytycznych.

Jednak w przeciwieństwie do myszy AMOT knockout, myszy AMOTL1 knockout posiadają poszerzony układ komór bocznych mózgu oraz cechują się hiperaktywnością ruchową, zmniejszoną lękliwością i zmniejszoną socjalnością. Wiele spośród zaobserwowanych przez nas fenotypów odpowiada tym, które obserwuje się w przypadku konkretnych chorób neuropsychiatrycznych, a które są zależne od struktury mózgu, jaką jest hipokamp.

Problemem badawczym niniejszego projektu, jest funkcja AMOTL1, jaką pełni ono w hipokampie, a stawiana przez nas hipoteza zakłada, że AMOTL1 jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania tej struktury, która zaangażowana jest w zapamiętywanie i formowanie sie pamięci, emocje, orientację przestrzenną, a także bierze udział w regulacji aktywności ruchowej i reakcji na stres. Celem weryfikacji naszej hipotezy wyprowadzimy linię myszy nieprodukujących białka AMOTL1 w hipokampie. Przeprowadzimy badania morfometryczne i histologiczne tkanki mózgowej, określimy behawior uzyskanych myszy, a także przeprowadzimy analizę morfologiczną neuronów uzyskanych z takich myszy.

Dodatkowo zbadamy mechanizm, w którym AMOTL1 reguluje morfologię i liczbę kolców dendrytycznych, skupiając się na ekspresji i lokalizacji wewnątrzkomórkowej białek będących potencjalnymi partnerami dla interakcji z AMOTL1. W swoich badaniach wykorzystamy szereg metod eksperymentalnych: wykorzystanie myszy transgenicznych, kompleksowe badania behawioralne, fluorescencyjne obrazowanie wybranych struktur i komórek mózgu, obrazowanie metodami mikroskopii konfokalnej, pierwotne hodowle neuronalne, oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek.