Techniki spektroskopowe i mikroskopowe w nanosondowaniu, modelowaniu i rozpoznaniu interakcji pomiędzy erytrocytami i komórkami śródbłonka naczyniowego na poziomie molekularnym – KIT

W ramach niniejszego projektu zostaną zaprojektowane i zastosowane spektroskopowe oraz mikroskopowe metody do nanoanalizy, modelowania i rozpoznawania oddziaływań pomiędzy erytrocytami (RBC) a komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) na poziomie molekularnym. Wielomodalne podejście badawcze obejmuje zastosowanie kombinacji technik takich jak: spektroskopia w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR), w szczególności spektroskopia nano-IR, spektroskopia Ramana (RS), w tym wzmocniona powierzchniowo spektroskopia Ramana (SERS) i rezonansowa spektroskopia Ramana (RRS), a także mikroskopia sił atomowych (AFM) oraz skanująca mikroskopia bliskiego pola optycznego (SNOM) we współpracy z technikami referencyjnymi.

Realizacja pięciu zadań projektu umożliwi:

1. Nano-IR w badaniu błon komórkowych – opracowanie i zastosowanie metody nano-IR do analizy zmian biochemicznych w nienaruszonych błonach RBC i EC oraz w błonach RBC oddziałujących z błonami EC.

2. Modelowanie interakcji błon z wykorzystaniem SERS – opracowanie i zastosowanie metody SERS do analizy zmian w błonach RBC oraz modelowania interakcji pomiędzy powierzchniami metalicznymi a RBC i EC.

3. AFM i RS w analizie mikropęcherzyków (MV) – analiza powierzchni błon komórkowych i MV pochodzących z RBC i EC oraz z ich wzajemnych interakcji, z wykorzystaniem mikroskopii w skali nano oraz spektroskopii biochemicznej wypuszczanych MV.

4. Śledzenie sygnałów przekazywanych przez NO z użyciem RRS – spektroskopowa analiza interakcji i komunikacji RBC–EC za pośrednictwem cząsteczki NO w systemach in vitro i ex vivo.

5. Wielomodalny opis interakcji – korelacja wyników uzyskanych za pomocą metod opartych na nano-IR, SERS, AFM, RS i RRS w celu określenia cech nienaruszonych RBC i EC oraz wpływu zmian w RBC na profil EC in vitro i ex vivo.

Projekt zakłada analizę pojedynczych, nienaruszonych komórek oraz komórek oddziałujących (RBC i EC) w systemach in vitro (ludzkie RBC i ludzkie komórki śródbłonka aorty – HAEC) oraz w podejściu ex vivo (RBC izolowane z modeli mysich miażdżycy, cukrzycy i niewydolności serca oraz EC z izolowanych naczyń).

Pierwsze zadanie skupia się na wykorzystaniu nano-IR do badania błon komórkowych RBC i EC, w których w warunkach in vitro wywołano zmiany związane z wiekiem i chorobami. Następnie przeprowadzona zostanie analiza błon komórek izolowanych z modeli mysich. Na koniec analizie poddane zostaną błony RBC w kontakcie z HAEC in vitro. Dla właściwego rozróżnienia sygnałów z błon nienaruszonych komórek, analizowane będą także izolowane błony oraz cytoplazma z użyciem FTIR-ATR, RS, SNOM i klasycznych metod analitycznych.

Drugie zadanie obejmuje projektowanie i zastosowanie metody SERS bez znaczników do analizy zmian biochemicznych w błonach EC i RBC. W dalszej kolejności opracowane zostaną metody SERS z wykorzystaniem znaczników do specyficznego rozpoznawania interakcji międzykomórkowych. Obejmie to projektowanie znaczników opartych na nanocząstkach metalicznych do analizy wybranych białek adhezyjnych istotnych w interakcjach RBC–EC. Techniki referencyjne będą obejmowały m.in. cytometrię przepływową do analizy ekspresji białek na powierzchni komórek oraz barwienia glikokaliksu RBC i EC.

Trzecie zadanie dotyczy analizy komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem mikropęcherzyków (MV), które mogą pełnić funkcję nośników informacji. MV wydzielane przez zmienione RBC i EC, jak również powstałe w wyniku ich interakcji, będą analizowane w skali nano na błonach komórkowych z zastosowaniem AFM. Dodatkowo, profil biochemiczny MV w supernatancie zostanie przeanalizowany z użyciem RS lub RRS. Techniki referencyjne obejmują cytometrię przepływową MV oraz analizę ich rozmiaru, średnicy, stężenia, a także właściwości biochemicznych, morfologii i elastyczności (ektacytometria).

Czwarte zadanie skoncentrowane jest na wykrywaniu i różnicowaniu początkowych czynników wyzwalających komunikację między RBC a EC, ze szczególnym uwzględnieniem zmian w hemoglobinie (Hb) wewnątrz RBC pozostających w kontakcie z EC. Ten aspekt będzie badany za pomocą specjalnie opracowanej metody RRS wspomaganej dodatkowymi technikami referencyjnymi (EPR, UV-Vis, analiza gazów krwi).

Wielomodalny opis interakcji pozwoli odpowiedzieć na pytanie, czy profil biochemiczny RBC uzyskany za pomocą spektroskopii i mikroskopii umożliwia określenie charakteru ich interakcji z EC oraz przewidywanie stanu komórek śródbłonka i odwrotnie.